一文深度了解细胞凋亡及检测

   细胞凋亡或称程序性细胞死亡（Programmed Cell Death, PCD）是细胞的生命现象之一，1972年由Kerr提出。它在机体的胚胎发育、组织修复及自身反应性T淋巴细胞的清除等方面起着十分重要的作用。细胞凋亡调节的失控可导致临床各种疾病的发生。如老年性痴呆与神经细胞凋亡过度有关，自身免疫性疾病和肿瘤与细胞凋亡的抑制有关。细胞凋亡有别于细胞坏死，它有一系列的细胞形态学和生物化学的改变，包括出现染色质浓缩、DNA降解、凋亡小体形成等。

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I流式细胞术检测细胞凋亡（AnnexinV-FITC/PI双染法）

一、原理

在正常的活细胞，磷脂酰丝氨酸（phosphotidylserine，PS）位于细胞膜的内侧，但在凋亡的细胞，PS 从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-Ⅴ（膜联蛋白-V）是一种分子量为35-36KD的Ca2+ 依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力结合。因此将Annexin-Ⅴ进行荧光素（如FITC、PE）或生物素（Biotin）标记，以标记了的Annexin-Ⅴ作为探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。

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碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但对凋亡的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将Annexin V与PI匹配使用，就可以将活细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞和死细胞区分开来。（PI也可以用7-AAD染色替代）

二、结果分析

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在二维散点图上，Annexin V是X轴，PI是Y轴，十字门将图片分为四个象限。其中根据Annexin V染色分为左右两部分，右侧（Q2/3）为Annexin V染色阳性；根据PI染色分为上下两部分，上方（Q1/2）为PI染色阳性。一般认为Annexin V单染的细胞是凋亡早期的细胞，PI单染的细胞是已经死亡的细胞，而双染是凋亡晚期的。

左上象限Q1：(AnnexinV-FITC)-/PI+，此区域的细胞为坏死细胞。也可能有少数的晚期凋亡细胞在其中，甚至机械损伤的细胞也包含其中。

右上象限Q2：(AnnexinV-FITC)+/PI+，此区域的细胞为晚期凋亡细胞。

右下象限Q3：(AnnexinV-FITC)+/PI-，此区域的细胞为早期凋亡细胞。

左下象限Q4：(AnnexinV-FITC)-/PI-，此区域的细胞为活细胞。

细胞凋亡率：Q2与Q3象限百分率的和。

三、方法步骤

1. 胰酶消化，1000rpm 4℃离心收集细胞，PBS清洗细胞二次。

2. 用1倍的Binding Buffer重悬细胞为1×10⁶/mL。

3. 取100 ul上述悬液至流式管中。

4. 分别加入5ul Annexin V和5ul PI（7-AAD）。

5. 混匀，室温避光孵育15min。

6. 加入400ul的Binding Buffer混匀后1h内进行流式检测。

II TUNEL试剂盒检测凋亡

一、原理

细胞凋亡中, 染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3'-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3'-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。由此，TUNEL成为了检测DNA片段化（细胞凋亡）的最常用方法。

二、方法步骤（荧光染色法-细胞样本为例）

1. 固定：制备好的细胞爬片，4% PFA 室温固定30min，PBS清洗3次。

2. 通透：破膜液破膜2次，每次5min，PBS清洗3次，每次2min。

3. 平衡：用50ul平衡缓冲液覆盖细胞。在室温下放置5-10min平衡。

4. 孵育：在平衡后的区域周围用吸水纸吸掉50ul平衡缓冲液中的大部分，然后加上50ul rTdT孵育缓冲液（提前配置冰上，避光）。湿盒，在37°C避光孵育60min.

5. 终止：加入300uL/well 2×SSC，室温放置15min以终止反应。

6. 洗涤：将细胞爬片浸入PBS中，室温放置5min。重复洗涤3次，以去除未掺入的荧光素-12-脱氧三磷酸尿苷，去除非特异染色。

7. 染核（蓝色）：1×hoechst染15min，PBS洗涤3次。

8. 封片：荧光显微镜下观察染色情况并拍照。（根据需要可选红光和绿光。）

（结果示例，来源文献）

三、方法步骤（DAB染色法-组织样本为例）

1.脱蜡和水化：脱蜡可以先 60ºC 20 min，再用使用二甲苯两次 5-10 min；而水化用梯度乙醇从高浓度到低浓度浸洗，这些以便后面的结合反应充分、均匀；

2.通透：一般根据切片的厚薄，选择蛋白酶K的孵育时间，常用 10-30 min，几 μm 切片用短时间；几十μm切片用长时间，通过摸索达到既不脱片，又能够使后面的酶和抗体进入胞内。

3.孵育：适当延长TUNEL反应液的时间。一般是37ºC 1 h，可以根据具体样本凋亡损伤程度，适当延长反应时间，但要结合最终的背景着色。

4.DAB显色：一般DAB反应10 min左右，结合镜下控制背景颜色，最长不超过30 min。

5.清洗非特异性染色：。在TUNEL反应后和酶标反应后需用PBS充分清洗次数（5次），这些清洗直接决定最后切片的非特异性着色程度。

6.内源性 POD 的封闭：对于肝脏、肾脏等血细胞含量多的组织，适当延长封闭时间和升高过氧化氢的浓度，可以达到很好的封闭效果，且不影响最终的特异性染色。

7.封片和拍照：封片后光学显微镜下拍照。

（结果示例，来源文献）

Tips：

1.蛋白酶K的目的是通透细胞膜和核膜，从而使反应试剂充分进入细胞核进行反应，提高阳性率。但浓度过高或孵育时间太长容易脱片，只要不脱片，好像影响不大，其作用类似与 Triton×100 等细胞通透剂。

2.蛋白酶K一般工作液浓度为 20 μg/ml,但浓缩液可配制1-10 mg/ml，可用 PBS 配制，也可用蛋白酶K缓冲液；配好后分装保存，-20ºC可以用半年，冻融后的可保存一个月。

3.蛋白酶K反应时间一般为10min（4 μm片子）-30 min（30 μm片子），具体时间长短与切片厚薄有关。过长易脱片、过短起不到通透效果。

4. DAB 显色反应大约需要10 min，勿使背景颜色过深。可根据切片组织来源和切片厚度、试剂盒种类摸索一下时间。

5.蛋白酶K工作液处理时间、温度须在范围内摸索，温度过高，时间过长，易破坏核酸结构，出现假阳性。

6. DNase 1一般室温，10 min 即可。

7.若是肝脏或肾脏，因富含内源性过氧化物酶，需要增加过氧化氢浓度和延长孵育时间。其他还可以加强灭活、缩短DAB孵育时间、PBS充分清洗，注意镜下把握好着色。

8.英文说明书中对组织细胞通透这一步中，加了“对难处理的组织的处理”，意思是用常规方法处理（如蛋白酶K)后，应该阳性而做不出阳性时，可用微波修复。

9.复染的目的是为了衬托组织形态结构，以利于结果分析，石蜡切片常用苏木素，核染成蓝色，冷冻切片常用甲基绿，核染成绿色。

10.蛋白酶K消化蛋白后，需要用封闭液。

11.荧光染色图片更鲜艳靓丽，DAB染色组织形态更清晰。

III细胞凋亡关键蛋白因子检测（WB）

（结果示例，来源文献）

（Cleaved caspase-3：凋亡关键因子；Bcl-2凋亡抑制蛋白；Bax凋亡促进蛋白。）

细胞凋亡关键蛋白Caspase-3：在细胞凋亡启动时，116kD的PARP在Asp216-Gly217之间被活化的Caspase-3剪切成31kD和85kD两个片段，使PARP锌指结构与DNA羧基端的催化区域分离，不能发挥正常功能。从而受PARP负调控的Ca²⁺依赖核酸内切酶活性增高，裂解核小体间的DNA，导致出现染色质浓缩、DNA降解、凋亡小体形成等。

★启动者（initiator）：如caspase-8、9，受到信号后，能通过自剪接而激活，然后引起 caspase级联反应，如caspase-8可依次激活 caspase-3、6、7。

★执行者（executioner或effector）：如caspase-3、6、7，它们可直接降解胞内的结构蛋白和功能蛋白，引起凋亡。

Caspase超家族成员

Bcl-2家族成员都含有1-4个Bcl-2同源结构域（BH1-4），并且通常羧基末端有一穿膜的结构域 (transmembrane region，TM)。其中BH4是抗凋亡蛋白所特有的结构域，BH3是与促进凋亡有关的结构域。

Bcl-2可与促凋亡Bax形成二聚体，如果Bax相对量高于Bcl-2，则Bax同二聚体的数量增多，从而促进细胞死亡；而如果Bcl-2相对量高于Bax，则促进形成Bcl-2/Bax异二聚体，并使Bcl-2同二聚体的量增多，从而抑制细胞死亡。

BCL-2家族成员

IV细胞凋亡信号通路（简略）

V细胞凋亡与疾病